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一、什么是類胡蘿卜素:
類胡蘿卜素是自然界中廣泛存在的黃色、橙紅色或紅色多烯物質(zhì)。它們是在胡蘿卜中發(fā)現(xiàn)的,因此得名。人體不能合成類胡蘿卜素,因此主要通過食物獲得。水果和蔬菜是類胡蘿卜素的主要食物來源。
類胡蘿卜素由8個(gè)類異戊二烯單元組成,根據(jù)分子組成可分為胡蘿卜素和葉黃素兩大類。前者只含有烴和氫兩種元素,而后者是前者的含氧衍生物,含有一個(gè)或多個(gè)氧原子形成羥基、羰基、甲氧基和環(huán)氧化合物。類胡蘿卜素最重要的代表是β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、蝦青素和斑蝥素。
二、類胡蘿卜素的作用:
膳食類胡蘿卜素是維生素的前體,可預(yù)防多種慢性退行性疾病。類胡蘿卜素分析對(duì)于了解它們對(duì)人類健康的重要性是必要的。然而,現(xiàn)有的用于分離主要類胡蘿卜素的高效液相色譜 (HPLC) 方法需要更長的分析時(shí)間,并且不能充分分離紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)。
類胡蘿卜素的一些特性,例如它們?cè)谧匀唤缰械拇嬖?、不同的濃度、?duì)異構(gòu)化的敏感性以及高度不飽和類胡蘿卜素的氧化,使得單個(gè)類胡蘿卜素的量化成為一項(xiàng) 具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。在分析類胡蘿卜素時(shí),需要采取預(yù)防措施以盡量減少異構(gòu)化、氧化和降解。
三、分離方法:
已經(jīng)采用了多種方法來檢測(cè)食品樣品中的類胡蘿卜素,從薄層色譜到高壓液相色譜 (HPLC) 以及 HPLC 與包括 MALDI-TOF 在內(nèi)的質(zhì)譜相結(jié)合。鑒定和定量類胡蘿卜素多用的方法是利用 HPLC 與紫外-可見吸收檢測(cè)相結(jié)合。
雖然使用正相和反相HPLC都可以進(jìn)行類胡蘿卜素的分離,但是由于非極性類胡蘿卜素的分離較差,正相HPLC不適用于類胡蘿卜素的分離。相比之下,反相 HPLC 能夠顯著增加分析物和非極性固定相之間的相互作用,從而提高類胡蘿卜素的分離度。
四、C18色譜柱:
在這些色譜柱中,等度或梯度模式的 C18 色譜柱是類胡蘿卜素分離的一種選擇。與 HPLC 相比,UHPLC 具有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì),例如更高的峰容量、更小的峰寬、更高的靈敏度和更高的色譜分離度。更短的分析時(shí)間也大大節(jié)省了流動(dòng)相溶劑。
USHA C18-G色譜廣泛用于分析極性物質(zhì)和疏水性物質(zhì),是集耐久性、良好峰形顯示和重現(xiàn)性特別于一身的ODS柱。由于 C30 固定相色譜柱無法用于 UHPLC,因此 C18 色譜柱已被用于類胡蘿卜素分離,盡管 C18 柱對(duì)類胡蘿卜素異構(gòu)體的分離度較差。
五、提取方法:
(根據(jù)各種類胡蘿卜素在提取溶劑中的溶解度和穩(wěn)定性確定具體方法)
固相萃取 (SPE)
液液萃取
超臨界流體萃取 (SFE)
基質(zhì)固相分散 (MSPD)
皂化
測(cè)定方法:紫外/可見分光光度法
高效液相色譜法(此類方法是分離、鑒定和定量食品和生物樣品中類胡蘿卜素的一種方法)
分析 HPLC 類胡蘿卜素的檢測(cè)器是光電二極管陣列 (PDA),但也可以使用電化學(xué)檢測(cè)器 (ECD)、熒光檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器 (MS) 和核磁共振 (NMR) 等檢測(cè)器。
六、流動(dòng)相:
類胡蘿卜素分離的優(yōu)化需要進(jìn)樣溶劑和流動(dòng)相的相容性。理想情況下,進(jìn)樣溶劑應(yīng)與流動(dòng)相相容或比反相極性更強(qiáng),以提供樣品的柱上濃度。如果類胡蘿卜素在進(jìn)樣溶劑中比在流動(dòng)相中更易溶解,特別是當(dāng)溶液接近飽和時(shí),進(jìn)樣時(shí)類胡蘿卜素會(huì)沉淀,導(dǎo)致峰拖尾?;蛘撸鼈儠?huì)在通過色譜柱時(shí)保留在進(jìn)樣溶劑中,從而產(chǎn)生寬帶和雙峰 。另一方面,如果進(jìn)樣溶劑太弱,樣品將不會(huì)*溶解在流動(dòng)相中。
樣品和溶劑過濾可防止小容量進(jìn)樣器接頭堵塞、劃傷和泄漏?;芈坊驈U液管路堵塞會(huì)導(dǎo)致高背壓和回路填充困難。位于閥進(jìn)樣器和色譜柱之間以減少譜帶展寬的低死體積接頭也容易堵塞。導(dǎo)致 HPLC 問題的其他因素包括不匹配或損壞的進(jìn)樣器組件、可變的樣品量、泄漏和增加的系統(tǒng)壓力。通過過濾,經(jīng)過適當(dāng)調(diào)整和清潔的注射器應(yīng)持續(xù) 5,000 次注射。
選擇合適的過濾器需要了解過濾器/溶劑的兼容性以及過濾器的化學(xué)/物理特性。恒譜生建議客戶選擇多階不銹鋼進(jìn)樣口過濾器,配套用于外徑1/8英寸或1/16英寸的管子,放置于流動(dòng)相溶劑瓶中,過濾雜質(zhì)。
選擇不正確的過濾器可能會(huì)導(dǎo)致可萃取物質(zhì)危及分析結(jié)果。對(duì)于色譜分析,由可萃取材料引起的情況包括樣品吸收、共流出和外來峰。