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一、分離模式
選擇色譜柱的首要任務(wù)是選擇分離模式。分離分子的方法有很多,其中應(yīng)用*泛的包括反相、正相、親水相互作用、離子交換和尺寸排阻 HPLC。還有一些不太常見但更專業(yè)的分離模式,例如使用手性固定相或流動相的特定手性色譜。
反相色譜柱通常用于非極性或弱極性有機化合物,它包含非極性固定相(如 C18),通常與極性流動相配對。恒譜生C18 AQ 反相色譜柱在水下?lián)碛?產(chǎn)品的壽命,適于極性較大的物質(zhì)在高水相條件下的分析。但是該方法不適合應(yīng)用于蛋白質(zhì),流動相通常含有低 pH 值的乙腈或甲醇,可能會使蛋白質(zhì)變性,因此會產(chǎn)生偽峰或?qū)е碌鞍踪|(zhì)聚集和色譜柱堵塞。
二、柱長
確定分離模式和色譜類型后,請考慮色譜柱長度。理想的柱長在某種程度上取決于您的特定樣品和分離模式。一般來說,更長的色譜分析柱需要更長的運行時間,但會產(chǎn)生更好的分離效果。柱長(有時稱為“床高”)對于根據(jù)大小分離蛋白質(zhì)特別重要。
三、填料的大小和類型
HPLC 柱床由直徑通常為 2 至 10 μm 的球形功能顆粒構(gòu)成。小于 2 μm 的粒徑用于UHPLC,超高壓液相色譜是在非常高的壓力下運行,因此它使用比 HPLC 更小的顆粒。恒譜生2μm硅膠基質(zhì)色譜填料,孔分布均勻、抗壓強度高,由于表面羥基活性高所以在中高壓情況下能達(dá)到快速分離純化的效果。一般而言,較小的粒徑可提供更高的分離率——但需要注意的是背壓也更大,以便將流動相泵入密度更大的色譜柱。
三、色譜填料的材料
常見的選擇有二氧化硅、羥基磷灰石和交聯(lián)聚合物樹脂。常見的疏水烷基鏈有 C4、C8 和 C18 等長度。通常,該材料對目標(biāo)分析物具有一定程度的選擇性——做出這種選擇對于優(yōu)化分離度很重要。例如,C18 更常用于分離肽或小分子,而 C4 更適用于蛋白質(zhì)。
技術(shù)發(fā)展也產(chǎn)生了新的粒子類別。一種稱為表面多孔顆粒 (SPP) 或核殼顆粒的新型二氧化硅基材料有望實現(xiàn)通過2 μm的粒徑實現(xiàn)更高的分離效率。通常,常規(guī)粒徑小于 2 μm 的 HPLC 色譜柱需要專門的 UHPLC 泵或系統(tǒng)來處理較高的背壓。與球形和全多孔的傳統(tǒng)二氧化硅顆粒不同,SPP 顆粒由一個實心二氧化硅核組成,其上覆有多孔二氧化硅殼,這些顆粒的優(yōu)點是它們表現(xiàn)出像 2 微米顆粒一樣的效率,顆粒尺寸從 2.6 微米及以上,但在略高于一半的背壓下運行。