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相信很多開發(fā)HPLC方法的實(shí)驗(yàn)研發(fā)人員都開發(fā)出了無法分離混合物重要成分的方法,其方法可以是調(diào)整流動(dòng)相、固定相或柱溫,另一種有效的方法是改變色譜柱粒徑。粒徑較小的液相色譜柱產(chǎn)生較高的塔板數(shù)以獲得更尖銳的峰,并且能夠分離緊密洗脫的峰。一些高分子量化合物在小孔徑填料上可能無法分離,但在用大孔徑填料填充的色譜柱上很容易分離。
通常解決緊密或共洗脫峰的有效的方法是改變流動(dòng)相組成或柱填料顆粒的鍵合相功能 。分辨率方程清楚地確定了影響峰分辨率的三個(gè)主要因素:其中Rs是兩個(gè)靠近洗脫峰的分辨率(間距);k是代表保留的容量因子;α 是靠近洗脫峰的容量因子的比率;N為代表柱效的柱塔板數(shù)。反相 HPLC 是一種非常強(qiáng)大的方法,通??梢院敛毁M(fèi)力地實(shí)現(xiàn)分離,有時(shí)甚至只需要初始操作條件。然而,重疊和疊加的峰通常會(huì)產(chǎn)生,因此需要改變操作條件。有幾種方法可以提高重疊峰的分辨率或帶間距,或者解耦疊加的峰。
一、相對(duì)保留的調(diào)整:
有時(shí)可以通過調(diào)整容量因子k(保留)值來對(duì)分離不嚴(yán)重重疊的峰進(jìn)行微小改進(jìn)降低流動(dòng)相的強(qiáng)度。
二、通過提高柱效提高分離度:
適度重疊的峰通??梢酝ㄟ^提高柱效來解決,通過增加柱塔板數(shù)來銳化峰(減少峰體積)。一種有效的方法是使用顆粒較小的色譜柱,因?yàn)檫@會(huì)增加塔板數(shù)并提高柱效。
三、通過改變流動(dòng)相有機(jī)改性劑增加譜帶間距:
在反相 HPLC 中改善譜帶間距的有效方法是改變流動(dòng)相成分以增加 α 值。如果在初始分離中觀察到嚴(yán)重重疊或疊加的峰,則此方法更適合。改變有機(jī)改性劑是產(chǎn)生峰間距變化的有效途徑。例如,如果初始分離使用乙腈作為有機(jī)改性劑并顯示出此問題,建議的方法是更換改性劑:先換成甲醇或再換成四氫呋喃。
根據(jù)實(shí)際情況,有時(shí)可以通過增加柱塔板數(shù)、使用更小的顆?;蛟黾又L(zhǎng)來改善分離。但這些方法的缺點(diǎn)是較高的操作壓力和較長(zhǎng)柱的分離時(shí)間增加。其中有效的方法是改變流動(dòng)相有機(jī)改性劑或色譜柱功能,在這種情況下分離時(shí)間不會(huì)增加,有時(shí)可以縮短以實(shí)現(xiàn)更快的分離。對(duì)于肽和蛋白質(zhì)等大分子,使用孔徑較大的色譜柱顆粒很重要。
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