反相色譜柱填料主要以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(ODS)稱為C18柱,其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱,GPC柱,聚合物填料柱等。
反相色譜柱的優(yōu)點是固定相穩(wěn)定,應用廣泛,可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料,使用時一定要注意流動相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8,流動相的PH值小于2時,會導致鍵合相的水解;當PH值大于7時硅膠易溶解;經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。
反相色譜柱的影響因素:
(1)柱長
有機小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加,但是柱長增加并不能使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加,它們在較短的柱子上往往也有很好的分離效果。
(2)流動相的流速。
有機小分子和肽類的分辨率對流動相流速非常敏感。而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小,柱子越長,色譜峰的寬度就越大,分辨率就越小。制備色譜上樣過程中的流速對動態(tài)吸附容量影響很大。
(3)溫度。
溫度上升,流動相黏度下降,流動速度加快,且流動相與固定相之間的傳質(zhì)速度加快,使分辨率增加。同時,溫度上升,分子熱運動增加,疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。
(4)流動相組成。
流動相的極性越大,溶質(zhì)的分配系數(shù)越大,洗脫時間越短。RPC多采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性較強的溶劑,在反相色譜中常常和基礎溶劑配合使用,向流動相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶劑,以得到不同強度的流動相,這些有機溶劑稱為修飾劑。反相色譜柱中常用的有機溶劑有甲醇和乙腈。此外,乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。有機溶劑梯度的大小也會影響分辨率,一般梯度越?。直媛试酱?。